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scATAC:人类基因组的染色质可及性图谱
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scATAC:人类基因组的染色质可及性图谱-1
scATAC:人类基因组的染色质可及性图谱-2
results3:
An atlas of cCREs in adult human cell types
成年人类的细胞类型cCRES图谱
为了识别 111 种细胞类型中的每一种中的可接近染色质区域，我们汇总了来自每个细胞簇的所有细胞核的染色质可接近性概况，并应用了针对单细胞数据优化的峰值调用程序。然后，我们合并了这些可访问的染色质区域，以获得 890,130 个non-overlapping cCRE 的列表（图 2A）。
这些 cCRE 涵盖了 ENCODE 联盟发布的 cCRE 注册表中 58.9% 的元件，还包括 420,152 个以前未注释的元素。为了对这些 cCRE 进行基准测试(benchmark)，我们接下来比较了在当前研究中由批量 DNase-seq 分析的生物样本和由 sci-ATAC-seq 识别的细胞类型之间的染色质可及性概况。总的来说，sci-ATAC-seq 细胞类型比bulk tissue或永生化细胞系生物样品更接近原代细胞类型生物样品，并且由 sci-ATAC-seq 定义的具有较高组织丰度的流行细胞类型与bulk tissue更相似,与DNase-seq 生物样本相比，具有更多稀有细胞类型。在当前研究中描述的 111 种细胞类型中，44 种（40%）与 ENCODE 联盟描述的任何大量生物样本没有显示出统计学上显着的相关性。这些细胞类型中有许多是罕见的：它们的最大组织丰度中位数仅为 3.2%，其中 36 个（81.8%）占任何组织中所有细胞的不到 10%。总之，这些研究结果表明，我们的数据集将以前代表性不足的 cCRE 从体内人类细胞类型贡献到现有目录中，特别是来自bulk tissue中丰度低的细胞类型。
为了评估这些 cCRE 的潜在功能，我们接下来将它们与转基因报告基因验证的哺乳动物增强子目录进行比较，发现经过验证的组织特异性增强子在占很大比例的细胞类型中，并且在对应组织中鉴定出的细胞核表现出更高的染色质可及性 (图 2B)。
例如，与其他细胞类型相比，心脏中经过验证的增强子在心房心肌细胞（Z 评分：1.41）和心室心肌细胞（Z 评分：1.43）中显示出更高的平均染色质可及性（图 2B），这表明细胞类型特异性之间存在良好的相关性染色质可及性和组织特异性增强子活性。我们进一步发现，来自 49 种成人组织类型（GTEx Consortium，2020）的表达数量性状基因座 (eQTL) 在流行的细胞类型中最常见，例如内皮细胞和平滑肌细胞。此外，来自同质组织（如肝脏和甲状腺）的 eQTL 在相应的细胞类型中显示出最强的可及性，这些细胞类型包含组织中鉴定的大部分细胞核。这些结果表明， bulk tissue eQTL 最能代表与丰富细胞类型和同质组织中的基因表达相关的序列变异，并且对于同质组织中的稀有细胞类型或异质组织中的独特细胞类型可能不太具有代表性。
接下来，我们根据到最近的 TSS 的距离对每个 cCRE 进行分类，如图 2A 所示。当前目录中的大多数 (80.94%) cCRE 与带注释的 TSS 相距超过 2,000 bp。直接位于 TSS 上方或启动子区域附近的 cCRE 显示出更高水平的序列保守性和更高的染色质可及性（图 2C 和 2D）。
相比之下，基因远端 cCRE 的可访问性较低，并且相对于其可访问性显示出更大的差异（图 2D），表明存在高度可访问的启动子近端 cCRE 的共享程序以及跨细胞类型和物种的基因远端 cCRE 的可变程序。为了进一步剖析细胞类型特异性染色质特征和调控程序，我们应用基于熵的策略揭示了 435,142 个 cCRE，这些 cCRE 在一种或几种细胞类型中表现出受限的可及性（图 2E）。
接下来，我们对细胞类型受限的 cCRE 应用了 GREAT GO富集分析和基序富集分析，以揭示每种细胞类型的推定生物学过程和 TF，这在很大程度上与预期的细胞类型特异性功能相关（ [FDR] 0.01） .例如，仅限于肝细胞的 cCRE 产生了生物过程GO Term，例如类固醇代谢过程（图 2F），
并且富含肝细胞核因子 TF 家族成员 HNF1A/B、HNF4A/G 和 ONECUT1/2 的结合位点（图 2G） 。
Go 由于不支持泛型而臭名昭著，但最近，泛型已接近成为现实。Go 团队实施了一个看起来比较稳定的设计草案，并且正以源到源翻译器原型的形式获得关注。本文讲述的是泛型的最新设计，以及如何自己尝试泛型。
例子
FIFO Stack
假设你要创建一个先进先出堆栈。没有泛型，你可能会这样实现：
type Stack []interface{}func (s Stack) Peek() interface{} {
return s[len(s)-1]
}
func (s *Stack) Pop() {
*s = (*s)[:
len(*s)-1]
}
func (s *Stack) Push(value interface{}) {
*s =
append(*s, value)
}
但是，这里存在一个问题：每当你 Peek 项时，都必须使用类型断言将其从 interface{} 转换为你需要的类型。如果你的堆栈是 *MyObject 的堆栈，则意味着很多 s.Peek().(*MyObject)这样的代码。这不仅让人眼花缭乱，而且还可能引发错误。比如忘记 * 怎么办？或者如果您输入错误的类型怎么办？s.Push(MyObject{})` 可以顺利编译，而且你可能不会发现到自己的错误，直到它影响到你的整个服务为止。
通常，使用 interface{} 是相对危险的。使用更多受限制的类型总是更安全，因为可以在编译时而不是运行时发现问题。
泛型通过允许类型具有类型参数来解决此问题：
type Stack(type T) []Tfunc (s Stack(T)) Peek() T {
return s[len(s)-1]
}
func (s *Stack(T)) Pop() {
*s = (*s)[:
len(*s)-1]
}
func (s *Stack(T)) Push(value T) {
*s =
append(*s, value)
}
这会向 Stack 添加一个类型参数，从而完全不需要 interface{}。现在，当你使用 Peek() 时，返回的值已经是原始类型，并且没有机会返回错误的值类型。这种方式更安全，更容易使用。（译注：就是看起来更丑陋，^-^）
此外，泛型代码通常更易于编译器优化，从而获得更好的性能（以二进制大小为代价）。如果我们对上面的非泛型代码和泛型代码进行基准测试，我们可以看到区别：
type MyObject struct {
X
int
}
var sink MyObjectfunc BenchmarkGo1(b *testing.B) {
for i := 0; i b.N; i++ {
var s Stack
s.Push(MyObject{})
s.Push(MyObject{})
s.Pop()
sink = s.Peek().(MyObject)
}
}
func BenchmarkGo2(b *testing.B) {
for i := 0; i b.N; i++ {
var s Stack(MyObject)
s.Push(MyObject{})
s.Push(MyObject{})
s.Pop()
sink = s.Peek()
}
}
结果：
BenchmarkGo1BenchmarkGo1-16 12837528 87.0 ns/op 48 B/op 2 allocs/opBenchmarkGo2BenchmarkGo2-16 28406479 41.9 ns/op 24 B/op 2 allocs/op
在这种情况下，我们分配更少的内存，同时泛型的速度是非泛型的两倍。
合约（Contracts）
上面的堆栈示例适用于任何类型。但是，在许多情况下，你需要编写仅适用于具有某些特征的类型的代码。例如，你可能希望堆栈要求类型实现 String() 函数
follicle发育是一个复杂的动态过程。follicle被包裹在基质中，一旦follicle发育，follicle就会在不断生长的过程中从皮层移动到髓质，最后到达皮层排卵 。许多这些过程不能仅用毛囊来解释。 通过对小鼠出生后follicle发育关键时间点的单细胞和空间转录组测序，发现ovarian基质细胞不仅是构成 ovarian的主要细胞群之一，其细胞群和空间位置也与follicle发育密切相关 。通过对 细胞通讯的分析发现， ovarian基质细胞是细胞间通讯的主要传递者，它们发出的许多信号被颗粒细胞和卵母细胞接收，参与follicle发育 。 ovarian基质细胞不是同质细胞群。 将单细胞类型与其空间位置信息相结合，将 ovarian基质细胞分为四种类型，即结构性基质细胞、滤泡周基质细胞、基质祖细胞和类固醇基质细胞，每种类型在follicle发育中发挥不同的功能 。对不同空间位置和不同类型基质细胞的深入研究将扩大对follicle发育动态的理解，为 ovarian相关疾病的治疗带来新的靶点和新方法。
ovarian由两部分组成： 实质和间质 。 follicle是 ovarian的功能单位，包括 ovarian实质，决定了女性的生殖寿命 。它由卵母细胞和嵌入 ovarian基质中的体细胞层（颗粒细胞和膜细胞）组成。 ovarian的大部分，包括皮质和髓质，由具有不同特征的基质组成。大多数follicle嵌入 ovarian皮质的基质中，并在 ovarian髓质的基质中成熟。历史上， ovarian生物学的研究主要集中在受卵母细胞和颗粒细胞（GCs）控制的follicle发生上，而follicle发生中存在许多未解决的问题，仅靠这两种细胞类型无法解释。除了构成follicle的细胞外，嵌入follicle的 ovarian基质对follicle发生有很大贡献，但没有得到足够的重视，因为它是理解follicle发生复杂过程的关键。
ovarian基质由一般成分组成，例如免疫细胞、血管、神经、细胞外基质和未完全表征的基质细胞的混合群体 。大部分 ovarian基质包含未完全表征的基质细胞，包括成纤维细胞样、梭形细胞形和间质细胞。 ovarian基质细胞在follicle发生中具有重要作用，特别是在原始follicle的激活和膜细胞的分化中 。次级follicle可以使用体外培养系统单独生长，而原始和初级follicle必须在含有基质成分的器官培养物中激活。此外，所有在体外培养后成功生产人中期 II (MII) 卵子的研究都使用机械方法而不是酶消化来从 ovarian组织中分离follicle，因为酶消化会对follicle造成损害，同时还能保持残留基质细胞的紧密结合，这些细胞与follicle进行密集的细胞间通讯，并可能具有分化成其他关键细胞类型的能力，例如膜细胞。此外，基质细胞共培养可以改善早期follicle的生长和存活，这对于将体外培养系统成功转化为灵长类动物和人类follicle至关重要。 ovarian基质细胞不仅为follicle发育提供结构支持，而且与follicle具有复杂的双向旁分泌信号。几种生长因子是follicle发生的关键调节分子，包括成纤维细胞生长因子、转化生长因子 β、血小板衍生生长因子、肝细胞生长因子和胰岛素样生长因子。然而， follicle和基质细胞之间的特定细胞 - 细胞分泌信号仍不清楚 。
尽管有这些新见解，但对 ovarian基质细胞的理解仍然有限，许多问题仍未得到解答。 ovarian基质细胞的不完整表征和分类导致研究中的混淆，这些研究报告了有关基质细胞的发现而没有进一步鉴定。 ovarian基质细胞不是指单个同质细胞群。最近的单细胞 RNA 测序 (scRNA-seq) 研究证实了多个基质细胞clusters的存在，但缺乏对整个 ovarian基质细胞类型的全面和完整的表征。基质细胞的分布和亚型可能会因其在 ovarian中的位置而异（例如，皮质与髓质）。 随着follicle的生长和排卵以及黄体的发育，基质细胞的分布也可能发生变化，伴随着周期性的结构变化。整个生殖寿命的变化也很明显，包括纤维化胶原蛋白的增加，如老年小鼠、女性和灵长类动物的 ovarian所示。对于这些不完全表征的基质细胞类型，仔细的本体论、进一步的标记识别以及对区域细微差别的关注是关键的下一步 。
在这项研究中， 生成了小鼠出生后 ovarian follicle发育的单细胞图谱和时空基因表达动态，阐明了 ovarian基质细胞在follicle发育中的重要作用。 细胞间通讯分析描绘了follicle发育不同阶段的细胞类型组之间复杂的细胞间通讯关系，并揭示 ovarian基质细胞是 ovarian中调节follicle发育的主要外向信号细胞类型 。 将 ovarian基质细胞完全表征为四个亚群，即结构基质细胞、滤泡周基质细胞、基质祖细胞和类固醇基质细胞，并进一步进行标记鉴定。 这些基质细胞亚群中的每一个在follicle发育中发挥不同的作用。
为了生成小鼠 ovarian的细胞图，说明follicle发育过程中的时间和空间变化， 通过单细胞 RNA 测序 (scRNA-seq) 和空间转录组学方法（10× Genomics Visium 载玻片和高分辨率显微镜） 。 五个时间点的 ovarian被整合到scRNA-seq 分析中：出生后第 3 天、第 5 天、第 7 天、3 周和 8 周。 三个时间点的 ovarian被整合到 10× Visium 分析中：出生后第 7 天、第 3 周和第 8 周。 后一种方法允许探索follicle发育中的细胞特征，以获得详细的细胞群和时间变化 。
能够生成 58,319 个细胞的 ovarian图谱，并根据其标记的表达识别出 21 个被分配细胞身份的clusters。 为了进一步识别clusters，根据已知的细胞类型标记基因分配clusters。 细胞特异性标记基因是卵母细胞（Sycp3）、颗粒细胞（Amhr2）、基质细胞（Col1a1）、内皮细胞（Cdh5）、上皮细胞（Krt19）、免疫细胞（Ptprc）、平滑肌细胞（Des）和 类固醇生成细胞 (Ptgfr)。 这些clusters可分为九个主要细胞类别：（i）基质细胞，（ii）颗粒细胞，（iii）卵母细胞，（iv）内皮细胞，（v）上皮细胞，（vi）免疫细胞，（vii）平滑细胞 肌肉细胞，（viii）类固醇生成细胞，和（ix）未定义的体细胞。 为了进一步获得基因特征的动态模式，鉴定了九个主要的细胞类别clusters特异性标记基因。 在这些细胞类型中，基质细胞和GCs占了绝大多数。
为了系统地绘制由 scRNA-seq 识别的细胞类型在 ovarian内的位置，使用了 10× Visium Spatial Transcriptomics 技术 。在第 7 天、第 3 周和第 8 周检查了三个 ovarian样本，它们代表了三个重要的 ovarian发育阶段。总体而言，使用统一流形近似（UMAP）和投影对九个转录不同的clusters进行分类和可视化。可以清楚地看到九个clusters的位置，伴随着follicle和黄体。然后， 将时空数据与 scRNA-seq 数据相结合，使用 SPOTlight 推断复杂 ovarian组织内细胞类型和状态的位置（关于SPOTlight，大家可以参考文章 10X空间转录组数据分析梳理 、 10X单细胞空间联合分析方法汇总及算法总结 、 10X单细胞空间分析回顾之SPOTlight ） 。如下所示， 将八个明确识别的细胞类别映射到 10×Visium 时空 ovarian组织中，发现基质细胞、内皮细胞和 GC 是卵母细胞周围的三个细胞类别 。可以看到 ovarian细胞类型的所有空间位置。
颗粒细胞（GCs）是follicle中不可或缺的一部分，直接与卵母细胞相互作用 。为了通过UMAP分析在调查期间剖析GC在发育过程中的异质性，将GC群体确定为11个clusters。为了获得基因特征的动态模式，鉴定了GC clusters特异性标记基因。 根据这些分析，绘制了一个遗传动态模型，包括在follicle发育过程中的低分化、mural、卵丘、类固醇生成和增殖性 GC 。已知在早期发育阶段 GC 中表达的基因是 Wt1 和 Foxl2；对于mural GC，Cyp19a1；对于卵丘细胞，Slc38a3 和 Amh；对于类固醇生成的 GC，Cyp11a1 和 Lhcgr。标记基因 Wt1、Slc38a3、Cyp19a1 和 Cyp11a1 在 10× Visium 切片中可视化，与真实的组织学位置相匹配。 低分化GCs的比例随着时间的推移而降低，而卵丘GCs、mural GCs和类固醇GCs的比例随着时间的推移而增加，并在3周或8周达到峰值 。结果与 ovarian和follicle发育过程中的 GC 动力学相匹配。然而，没有发现任何明显的边界来将原始follicle到窦follicle的 GC 分组。
为了剖析整个调查期间 GC 的命运决定，根据上面报道的基因表达，它们沿着伪时间轨迹排列 。获得了三个状态（在伪时间分析中使用的术语，其中“state”被分配来标记 Monocle 中轨迹树的片段）。此外，代表基因（上面确定的 3 个follicle形成阶段的标记基因）的表达以及伪时间轨迹与我们的推断一致。根状态包含大部分差异较小的 GC；状态 1 包含大部分积云 GC、mural GC 和增殖 GC；状态 3 包含大多数类固醇生成 GC。在这样的伪时间轨迹中，3 个分支暗示了具有细胞标记的 GC 的 3 个分化阶段，例如 Wnt6、Wt1、Hmgb2 和 Cyp11a1。对这三个州的代表性基因的 GO 分析显示了相关的途径。此外，分析了两种主要细胞群（基质细胞和 GC）与其他细胞类型之间的细胞串扰。如下图所示， 除了 GC 和其他细胞类型之间广泛的细胞间通讯外，基质细胞和其他 ovarian细胞类型之间的细胞间通讯也更强 。
为了分析这些细胞类型在小鼠 ovarian中的通讯，进一步进行了 CellChat 分析（关于CellChat，大家可以参考文章 10X单细胞（10X空间转录组）通讯分析之CellChat 、 10X单细胞（10X空间转录组）通讯分析CellChat之多样本通讯差异分析 ），以确定follicle发育过程中这些细胞类型之间的细胞通讯 。第 3 天、第 5 天、第 7 天、第 3 周和第 8 周的推断交互次数分别为 723、455、522、329 和 602，第 3 天的交互强度，第 5 天、第 7 天、第 3 周和第 8 周分别为 22.525、6.705、10.16、3.534 和 4.065。 发现第 3 天、第 7 天和第 8 周是细胞通讯的最强时间点 。因此，更多地关注第 3 天、第 7 天和第 8 周。 ovarian中的九种细胞类型之间存在非常复杂的细胞通讯，而基质细胞是信号最强的细胞类型 。进一步的信号传导作用分析表明，在六个重要的 ovarian发育时期， 基质细胞在细胞间通讯中表现出最强的外向相互作用 。 GCs 是在第 3、5 和 7 天接收最多传入受体信号的细胞类型，而上皮细胞是在 3 周和 8 周接收最多传入受体信号的类型。此外，在选定的时间过程中探索了特定类型的细胞通信。 发现基质细胞经常与所有其他细胞交流 。特别是，PTN、MK、ncWNT、PROS、GAS、ANGPTL 和 TWEAK 信号通路积极参与基质细胞的输出信号模式。在传出信号中，MK 在整个follicle发育阶段表达。 PTN 仅在第 3 天、第 5 天和第 7 天检测到，此时原始follicle激活和follicle发育为初级和次级follicle。比较了第 3 天和第 5 天，当原始follicle被激活时，发现 ncWnt、PROS、APELIN、GRN、CALCR、ACTIVIN、IFN-1 和 LIFR 在第 2 天特异性表达，而 IL -1 和 ANNEXIN 在第 5 天特异性表达。其他信号通路，如 TWEAK、PTN 和 MK，在第 5 天的表达水平高于第 5 天。当比较第 7 天和第 5 天的相对信息流时，发现IL-1、ANNEXIN、CCL、BMP、FGF 和 ENHO 在第 5 天特异性表达，而 TWEAK、APELIN、ANGPT、CALCR、CXCL、AMH、PERIOSTIN、PROS、EDN 和 MIF 在第 7 天特异性表达。其他信号通路，如 PTN 和 MK，在第 7 天的表达水平高于第 5 天。还将第 7 天的信号传导与第 3 周的信号传导进行比较，发现 PTN、TWEAK、EDN、MIF、TNF、WNT 、PERIOSTEIN、CXCL、CALCR、APELIN、IL-2和CSF在第7天特异性表达，而NPR2和HH在第3周特异性表达。 这些细胞信号通路在特定follicle发育阶段发生变化，表明分泌信号可能有助于follicle发育阶段 。由基质细胞分泌的 MK 等分泌因子随着follicle激活持续存在，直至follicle完全生长，这可能代表了基质细胞发送的支持follicle发育的重要信息。分析绘制了follicle发育中的关键信号通路。因此， follicle发育过程中这些细胞群之间的细胞通讯提供了更多关于follicle发育调控网络的信息 。
此外，分析了 ovarian基质细胞的 genetic dynamics 。当基质细胞的转录组与发育阶段一起绘制时，鉴定出 11 个细胞clusters。如前所述，鉴定了每个clusters内的新标记基因，其表达根据发育阶段而变化。 CytoTRACE 分析表明clusters 6、7 和 8 可能是基质细胞的root（关于CytoTrace，大家可以参考文章 10X单细胞轨迹分析（拟时分析）之cytotrace ） 。对已识别clusters的特殊细胞标志物的特征图分析表明，Tcf21 在整个 ovarian基质中的表达最高，Lum 表达主要在cluster 0、1、2、4、5 和 10 中。 Star 和 Cyp17a1 主要在cluster 1 和 9 中表达，Enpep 主要在cluster 3、7 和 8 中表达，干细胞标记物 Aldh1a2 主要在cluster 6 中表达。基因 Lum、Cyp17a1、Enpep和 Aldh1a2 在 10× Visium 切片中可视化，并使用原位杂交 (ISH)、免疫组织化学 (IHC) 或免疫荧光 (IF) 进行验证。 follicle周围基质细胞中的 Lum 表达支持follicle的生长 。 Cyp17a1不仅位于follicle周围的膜细胞中，而且还位于膜外的一些基质细胞中。此外，Enpep 表达与follicle发育有关，并通过 ISH 得到证实。 Aldh1a2主要在 ovarian上皮和 ovarian皮质基质中表达。结果表明， ovarian基质细胞不是指单一的同质细胞群，可以借助 scRNA-seq 和空间转录组学方法进行明确分类 。
为了剖析整个研究期间基质细胞的命运决定，根据基因表达沿伪时间轨迹对它们进行排序 。可以看到第3天、第5天和第7天的大部分细胞处于root状态，而基质细胞在第7天开始分化。这一发现表明第7天是基质细胞分化的时间点。细胞伪时间轨迹显示 5 个基质细胞状态和 2 个分支点。clusters 6 和 10 处于根状态的起点。结合 CytoTRACE 的结果和特定的细胞标志物进行综合分析，发现cluster 6 可能是基质细胞的祖细胞。该cluster的特征在于与生物过程相关的基因的表达，例如“PI3K-Akt 信号通路”、“粘着斑”和“内质网中的蛋白质加工”，这些基因在状态 1 细胞，表明基质细胞具有幼稚的典型功能。编码“脂质和动脉粥样硬化”、“MAPK 信号通路”和“FoxO 信号通路”成员的基因属于状态 3，证实了基质细胞中存在类固醇激素产生。状态 5 由编码参与“亨廷顿病”、“肌萎缩侧索硬化”和“氧化磷酸化”的蛋白质的基因组成，这表明这些基质细胞处于高功能状态。基因Ptn和Gstm6主要表达在状态1，Enpep主要表达在状态5，Star主要表达在状态 3。此外， 鉴定出4个具有不同模式的基因组，4个基因组的特异代表基因，即 Sfrp1、Fhl2、Tmem100 和 Cebpb 。
为了进一步验证 ovarian基质细胞分类，在 E11.5 和 8 周之间的 11 个时间点对follicle和小鼠 ovarian周围的人 ovarian组织进行了分析 。分析中包括具有直径为 2 mm 和 5 mm 的follicle的人类 ovarian组织。根据已知的细胞标志物， ovarian细胞可分为5个细胞亚群，基质细胞可分为6个clusters。ENPEP+ 滤泡周围基质细胞和 CYP17A1+ 类固醇生成基质细胞包围了人类follicle。然后， 在 E11.5 和 1 天之间的六个时间点将数据与 ovarian整合，并确定了 11 种 ovarian细胞类型。在这些细胞类型中，基质细胞和 GC 也占人口的绝大多数。基质细胞分为 10 个cluster，大多数 Aldh1a2+ 基质祖细胞在 E11.5 和伪时间轨迹的根部出现 。
为了更深入地了解上述四组细胞的功能， 使用 SCENIC 进一步研究了基质细胞特异性 TF 的调节子（转录因子（TF））活性 。在follicle发育过程中确定了几个重要的 TF。基于具有默认过滤参数的 5,481 个过滤基因的 51 个调节子活性，调节子活性与发育阶段相匹配，并列出了具有代表性的调节子。如图所示，一系列 TF 显示出更加动态的模式。例如，Maf、Wt1、Gata6 和 Erg1 主要在早期发育阶段活跃。随着follicle发育的继续，Foxo1、Runx1、Stat1 和 Smarca4 似乎主要在follicle成熟的 3 周和 8 周阶段被激活。由于基质细胞在第 7 天开始在细胞伪时间轨迹中分化成不同的命运，专注于这个时间点。 Yy1、Jdp2、Cebpb 和 Maff 主要在第 7 天活跃。Bclaf1 的调节子活性在第 7 天特别关闭。 这些调节子活性模式可能为 ovarian基质细胞命运的确定提供新的见解 。
此外，当将调节子活性与 ovarian基质细胞亚群联系起来时，发现一些 TF 显著代表特定的 ovarian基质细胞亚群 。 Gata6 和 Wt1 主要在没有滤泡周围基质细胞的基质细胞亚群中活跃。 E2f1 和 Ezh2 主要在滤泡周基质细胞中活跃。 Maff 和 Irf1 等 TF 主要在类固醇基质细胞中活跃。 Irx3、Runx1 和 Smad3 主要在基质祖细胞亚群中活跃。
由于 MK 信号在整个follicle发育阶段表达，将 midkine 添加到与包裹在藻酸盐中的follicle共培养中，以进一步证实外向 ovarian基质细胞信号在follicle发育中的作用。 ovarian基质细胞是外向 MK 信号的主要来源，并且GC是主要目标。受体-配体分析表明，Ncl、Sdc4、(Itga6+ Itgb1) 和 Lrp1 是 MK 信号传导的主要贡献者。从第 3 天、第 5 天、第 7 天、第 3 周和第 8 周对小鼠 ovarian进行了 Mdk ISH 分析。Mdk 主要位于 ovarian基质中，在第 5 天小鼠 ovarian中表达最高。随着follicle的发育，Mdk表达主要发生在生长follicle周围的基质中，而在窦状follicle或黄体周围减少，表明它可能在follicle发育和成熟中起重要作用。然后研究了 Mdk 配体的表达和定位。 ISH和IHC均显示Ncl和Lrp1主要在生长follicle的GCs中表达。接下来，将纯化的 MK 添加到培养基中，以在体外与早期次级follicle共培养。结果表明，midkine 显著促进了follicle生长的增加。这些结果证实了 ovarian基质细胞与follicle的串扰作用促进了follicle的发育。
为了研究基质细胞亚群在follicle发育中的作用，使用 ENPEP-PE 抗体通过流式细胞仪分选获得了follicle周围基质细胞。 ENPEP+ 滤泡周围基质细胞比 ENPEP- 细胞更像成纤维细胞。免疫荧光分析显示 ENPEP+ 滤泡周围基质细胞表达 ENPEP 和 COL1A1 但不表达 FOXL2。 ENPEP-细胞不表达 ENPEP 或 COL1A1 并且具有高水平的 FOXL2 表达。 qPCR 分析显示 ENPEP+ 滤泡周围基质细胞具有较高水平的 Pdgfa、Enpep 和 Mdk，而较低水平的 Amhr2 和 Foxl2。在细胞培养过程中，ENPEP+ 滤泡周围基质细胞在传代到第三代 (P3) 时不能增殖，这表明 ENPEP+ 滤泡周围基质细胞可以在体外分化。膜细胞标志物 Star 和 Cyp17a1 的免疫荧光和 qPCR 分析证实，ENPEP+ 滤泡周围基质细胞在长期体外培养中分化为膜样细胞。结果揭示了 ovarian基质细胞类型分类的重要性。这些结果表明， 滤泡周基质细胞不仅具有旁分泌作用，而且还具有分化功能 。
生活很好，有你更好
文/孟永辉
近期，云知声向上交所撤回了科创板上市申请。据了解，公司本次主动撤回IPO申请，主要是出于公司战略发展因素考虑。
但凡对语音行业稍有了解，就一定不会对云知声这家企业感到陌生。 作为一家以AI语音技术起家的独角兽企业，云知声以其“云-端-芯”的战略思维，从语音交互入手，逐渐构筑起了一个包括机器学习平台、AI芯片、语音语言、图像及知识图谱等技术的技术城池。
规模优势显著，先后获多家知名机构青睐
云知声成立于2012年6月，是一家为企业和用户提供智能语音技术和综合解决方案的人工智能企业。那时候，AI创业在行业中尚属稀缺，深度学习也尚未完全成熟，就连举世闻名的Alpha Go大战李世石也发生在四年之后。但是在那时候，云知声就已经一头扎入了AI交互方案的研发，并在2012年底，就完成了包括语音云、深度学习及超算平台的三驾马车构建，率先将深度学习应用到语音识别产业服务中，通过深厚扎实的技术研发奠定了在行业中的广泛影响力。
2012年云知声首家推出语音开放平台、率先将DNN引入语音领域；2015年启动造芯并与2018年5月推出业界首款语音AI芯片，2019年年初发布多模态AI芯片战略，与吉利旗下 科技 公司成立合资公司研发车轨级AI芯片（已完成所有车轨级验证报告） ；在业界率先提出“云-端-芯”产品战略等举措都让云知声在行业内体现出来非同一般的领跑能力。
就拿芯片来说，芯片的重要性，自然就不必细说了吧。而「造芯」，似乎也成为了AI企业的技术标配。云知声自然如此，甚至要比大部分企业察觉的要早。
他们在2015年，阿尔法狗掀起AI浪潮的前一年，就率先宣布搭建了芯片团队，着手开发 uDSP 处理器和 DeepNet IP 技术。
2018 年，云知声就率先交付人工智能语音芯片——「雨燕」。
2019 年，推出了车规级芯片「雪豹」和面向家居领域的第二款升级版芯片「蜂鸟」系列，并启动具备“图像+语音”多模态交互功能的芯片「海豚」的研发。
云知声作为国内为数不多拥有全链条语音交互技术的人工智能企业，八年时间成长为领域领军企业，不仅在技术且在商业化道路方面，也呈领跑趋势。长期以来，公司在研发层面的重金投入，也在伴随市场的不断成熟转换成规模优势。2017年-2019年，云知声营收分别为6114.07万元、1.97亿元、2.19亿元，年均复合增长率高达89.14%。
值得一提的是，自成立以来，云知声完成多轮融资。2019年4月1日，云知声完成D轮融资，投资方为中金公司、东方证券及清和泉资本，还曾在2018年7月完成6亿元C+轮融资，中国互联网投资基金领投；C轮共融资1亿美元，投资方为前海梧桐并购基金，创下语音技术领域单轮融资最高记录。2014年公司获得了高通创投及老股东启明创投的B轮融资。
挖掘市场细分需求，技术赋能生活场景
目前，云知声自主研发三类芯片IP（深度学习处理器芯片IP、数字信号处理器芯片IP、图像处理芯片IP），都已经投入使用，并在持续优化中。应用场景涵盖智能家居、智能医疗、车载产品、教育机器人等语音、图像交互场景中。
医院和家居这两种场景的语音交互方案，都是云知声目前已经落地并广泛应用的产品。可见，人工智能已经逐渐渗透并细微如丝地改变着我们的生活。
据统计，约有一半以上的医生每天有超过两个小时的时间都在记录和整理病历，占用医生工作时间的比例非常之高。而在北京协和医院，通过一款软件、一个麦克风，医生只需口述诊断，病历就能自动生成在PC屏幕上。这不仅帮助医生提高了工作效率，更能将病历模板转化为高质量的诊疗数据。
这一技术的出现，大大地促进了医疗人工智能水平的推进。在家居场景下，人们通过远场识别技术，用语音控制空调、照明和音箱等各种智能设备，完全解放了双手。
云知声从2016年切入医疗领域至今，积累了深厚的医疗专业技术。借助于合作医院以及自由专业医生团队以及原有的自然语言处理技术，云知声构建了大规模全科室的医疗知识图谱。在此过程中和中科院自动化所合作的论文获得CCKS (知识图谱与语义计算大会 2019) 最佳论文，《大规模知识图谱构建及其应用》获得2019年北京市 科技 进步一等奖。云知声的医疗知识图谱以及相关应用平台也被多家三甲医院采购。
可以看出，云知声东南总部作为福建省唯一具备语音识别、超算能力、深度学习算法、大数据、芯片能力等人工智能底层技术全链条的企业，正发挥自身已经积累多年的技术实力和资源优势，时刻寻找着机会，在疫情时期乃至后疫情时代，企业纷纷进行 科技 转型的浪潮中，脱颖而出，成为企业升级的“助推器”。
同时，可以预见的是，一旦云知声智慧物联在酒店、地产等领域起势，或将贡献不菲的收入，进一步拓宽其营收来源。由此可见，云知声发力造芯，并力推商业化落地这步棋走对了。因此，你会看到，自2018年推出自研芯片“雨燕”后，其营收结构大为改善，不仅实现较快增长，并保持逐年增长的态势。
今年上半年，得益于规模化推广“蜂鸟”，并放弃毛利率较低的产品，云知声智能语音交互产品直接硬件采购成本占比降至26.17%，毛利率显著回升。种种迹象表明，经过多年实践，云知声“云-端-芯”这一战略已完善成为一套成熟的逻辑闭环，具备面向市场需求的快速产品化能力。考虑到AI产业经过大浪淘沙后玩概念、讲故事那套已行不通，像云知声这种玩转商用化落地的玩家才吃香。
研发持续高投入，核心技能自主可控
在生活场景逐渐被AI渗透的时代，技术是一个公司的安身立命之本。 云知声是最注重技能立异的AI企业之一，由于其深知核心技能自主可控是一家AI企业的安身立命之本。 在我看来，云知声之所以构筑技能优势，既与开创团队对技能的注重有关，也与在研制上坚持高额投入密不可分。
一方面，云知声四位联合开创人均具有清一色的技能背景，董事长兼CTO梁家恩与副总裁康恒均结业于中科院自动化所，CEO黄伟与副总裁李霄寒均在摩托罗拉等企业积累丰厚的实战经验。开创团队对技能注重，为公司发展定下技能立业的主基调，不遗余力地招募技能人才。数据显示，云知声团队规模已超500人，其间研制团队多达344人，占比超68%。
在算法方面，公司在机器学习前沿技术和专项应用技术方面始终保持高效的演进速度：公司于2012年率先将深度神经网络（DNN）应用于商业语音识别系统，并在后续的人工智能浪潮中持续进行前沿算法的商业实践，例如，后来涌现的卷积神经网络（CNN）、回归神经网络（RNN）、端到端序列建模、生成对抗网络（GAN）、注意力转换模型（Transformer）、双向编码表征转换模型（BERT）、知识蒸馏（KD）、自监督学习（SSL）等主流技术方法，公司都是业界最早的产业实践者之一。
另一方面，一直以来，云知声在技能投入上高举高打，直观的数据最能说明问题。招股书显示，2017年至本年上半年，公司研制投入分别为0.99亿元、1.52亿元、2.58亿元和9242万元，占营收比重分别为163.5%、77.6%、117.7%和109.1%，累计研制投入占累计营收比重为107.4%。换言之，云知声营收简直全部投入到研制中。
不难看出，云知声是一家有技能崇奉的AI企业，为继续构建核心技能和产品系统、坚持竞争力，大手笔砸向研制。
归根结底，一家AI企业成长的意义不仅仅是能获取多少高额利润，而是它的技术和产品能给人们生活带来多少品质的提升、给产业带来多少降本增效的价值、给 社会 带来多少效益。
“如果声音有形状，那一定是爱（AI）的样子”，正如云知声对企业的赋能作用始终与 科技 同行，云知声汇集了一群有梦想和共同愿景的人，相信 科技 改变世界，相信人工智能会让未来生活更美好。
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孟永辉，资深撰稿人，专栏作家，特约评论员，行业研究专家，战略咨询顾问。长期专注行业研究，累计发表 财经 科技 文章超400万字。支持保留作者来源的分享，转载请保留作者版权信息，违者必究。